IPTG (isopropyl-β-D-thiogalactoside) သည် β-galactosidase substrate ၏ analogue တစ်ခုဖြစ်ပြီး၊ ၎င်းသည် inducible အလွန်ဖြစ်သည်။ IPTG ၏ induction အောက်တွင်၊ inducer သည် repressor protein နှင့် complex တစ်ခုဖွဲ့စည်းနိုင်သောကြောင့် repressor protein ၏ conformation ကိုပြောင်းလဲစေပြီး target gene နှင့်ပေါင်းစပ်၍မရဘဲ target gene ကိုထိရောက်စွာဖော်ပြနိုင်မည်ဖြစ်သည်။ ဒါဆိုရင် စမ်းသပ်မှုအတွင်း IPTG ၏ပါဝင်မှုကို ဘယ်လိုဆုံးဖြတ်သင့်လဲ။ ကြီးလေ ပိုကောင်းလေလား။
ပထမဦးစွာ IPTG လှုံ့ဆော်မှု၏ အခြေခံမူကို နားလည်ကြပါစို့- E. coli ၏ lactose operon (ဒြပ်စင်) တွင် Z၊ Y နှင့် A ဟူသော ဖွဲ့စည်းပုံဆိုင်ရာ မျိုးဗီဇသုံးမျိုးပါဝင်ပြီး ၎င်းတို့သည် β-galactosidase၊ permease နှင့် acetyltransferase တို့ကို အသီးသီး encode လုပ်သည်။ lacZ သည် lactose ကို glucose နှင့် galactose သို့မဟုတ် allo-lactose အဖြစ် hydrolyzed လုပ်သည်။ lacY သည် ပတ်ဝန်းကျင်ရှိ lactose ကို ဆဲလ်အမြှေးပါးမှတစ်ဆင့် ဖြတ်သန်းပြီး ဆဲလ်ထဲသို့ ဝင်ရောက်စေသည်။ lacA သည် acetyl-CoA မှ acetyl အုပ်စုကို β-galactoside သို့ လွှဲပြောင်းပေးပြီး Toxic effect ကို ဖယ်ရှားခြင်းပါဝင်သည်။ ထို့အပြင်၊ operating sequence O၊ starting sequence P နှင့် regulatory gene I ရှိသည်။ I gene code သည် operator sequence ၏ position O နှင့် ချိတ်ဆက်နိုင်သော repressor protein တစ်ခုဖြစ်သောကြောင့် operon (meta) ကို ဖိနှိပ်ပြီး ပိတ်ထားသည်။ initiating sequence P ၏ အထက်ပိုင်းရှိ catabolic gene activator protein-CAP binding site အတွက် binding site တစ်ခုလည်း ရှိသည်။ P sequence၊ O sequence နှင့် CAP binding site တို့သည် lac operon ၏ regulatory region ကို ဖွဲ့စည်းသည်။ မျိုးဗီဇထုတ်ကုန်များ၏ ညှိနှိုင်းထားသော ဖော်ပြမှုကို ရရှိစေရန်အတွက် အင်ဇိုင်းသုံးခု၏ ကုဒ်လုပ်ထားသော မျိုးဗီဇများကို တူညီသော ထိန်းညှိပေးသည့် ဒေသဖြင့် ထိန်းညှိပေးသည်။
လက်တို့စ်မရှိသည့်အခါ lac operon (meta) သည် ဖိနှိပ်မှုအခြေအနေတွင် ရှိနေသည်။ ဤအချိန်တွင် PI promoter sequence ၏ ထိန်းချုပ်မှုအောက်ရှိ I sequence မှ ဖော်ပြထားသော lac repressor သည် O sequence နှင့် ချိတ်ဆက်ပြီး RNA polymerase သည် P sequence နှင့် ချိတ်ဆက်ခြင်းမှ တားဆီးပေးပြီး transcription initiation ကို တားဆီးပေးသည်။ လက်တို့စ်ရှိနေချိန်တွင် lac operon (meta) ကို လှုံ့ဆော်နိုင်သည်။ ဤ operon (meta) စနစ်တွင်၊ အစစ်အမှန် inducer မှာ lactose ကိုယ်တိုင်မဟုတ်ပါ။ Lactose သည် ဆဲလ်ထဲသို့ ဝင်ရောက်ပြီး β-galactosidase မှ catalyzed လုပ်ကာ allolactose အဖြစ် ပြောင်းလဲပေးသည်။ နောက်ပိုင်းတွင် inducer မော်လီကျူးတစ်ခုအနေဖြင့် repressor ပရိုတိန်းနှင့် ချိတ်ဆက်ပြီး ပရိုတိန်းပုံသဏ္ဍာန်ကို ပြောင်းလဲစေပြီး repressor ပရိုတိန်းကို O sequence နှင့် transcription မှ ခွဲထွက်သွားစေသည်။ Isopropylthiogalactoside (IPTG) သည် allolactose နှင့် တူညီသောအကျိုးသက်ရောက်မှုရှိသည်။ ၎င်းသည် အလွန်အစွမ်းထက်သော inducer တစ်ခုဖြစ်ပြီး ဘက်တီးရီးယားများမှ ဇီဝဖြစ်စဉ်ပြောင်းလဲခြင်းမရှိဘဲ အလွန်တည်ငြိမ်သောကြောင့် ဓာတ်ခွဲခန်းများတွင် ကျယ်ကျယ်ပြန့်ပြန့်အသုံးပြုကြသည်။
IPTG ရဲ့ အကောင်းဆုံးပါဝင်မှုကို ဘယ်လိုဆုံးဖြတ်မလဲ။ E. coli ကို ဥပမာအနေနဲ့ ယူပါ။
positive recombinant pGEX (CGRP/msCT) ပါဝင်သော E. coli BL21 မျိုးရိုးဗီဇပြုပြင်ထားသော မျိုးကွဲကို 50μg·mL-1 Amp ပါရှိသော LB အရည်အလယ်အလတ်ထဲသို့ ထည့်သွင်းပြီး 37°C တွင် တစ်ညလုံး မွေးမြူခဲ့သည်။ အထက်ဖော်ပြပါ ယဉ်ကျေးမှုကို တိုးချဲ့မွေးမြူရန်အတွက် 50μg·mL-1 Amp ပါရှိသော 50mL လတ်ဆတ်သော LB အရည်အလယ်အလတ်ပုလင်း ၁၀ လုံးထဲသို့ 1:100 အချိုးဖြင့် ထည့်သွင်းခဲ့ပြီး OD600 တန်ဖိုးသည် 0.6~0.8 ဖြစ်သောအခါ IPTG ကို နောက်ဆုံးပါဝင်မှုတွင် ထည့်သွင်းခဲ့သည်။ ၎င်းသည် 0.1၊ 0.2၊ 0.3၊ 0.4၊ 0.5၊ 0.6၊ 0.7၊ 0.8၊ 0.9၊ 1.0mmol·L-1 ဖြစ်သည်။ တူညီသောအပူချိန်နှင့် တစ်ချိန်တည်းတွင် induction ပြုလုပ်ပြီးနောက်၊ ဘက်တီးရီးယားအရည် 1 mL ကို ၎င်းမှထုတ်ယူခဲ့ပြီး၊ ဘက်တီးရီးယားဆဲလ်များကို centrifugation ဖြင့်စုဆောင်းကာ SDS-PAGE ဖြင့် ပရိုတင်းဖော်ပြမှုအပေါ် မတူညီသော IPTG ပါဝင်မှုများ၏ သြဇာလွှမ်းမိုးမှုကို ခွဲခြမ်းစိတ်ဖြာပြီးနောက်၊ အကြီးဆုံးပရိုတင်းဖော်ပြမှုရှိသော IPTG ပါဝင်မှုကို ရွေးချယ်ခဲ့သည်။
စမ်းသပ်ချက်များပြီးနောက် IPTG ၏ ပါဝင်မှုသည် များနိုင်သမျှ များမည်မဟုတ်ကြောင်း တွေ့ရှိရပါမည်။ ၎င်းမှာ IPTG တွင် ဘက်တီးရီးယားများအပေါ် အဆိပ်သင့်မှုအချို့ရှိသောကြောင့်ဖြစ်သည်။ ပါဝင်မှုထက် ကျော်လွန်သွားခြင်းသည် ဆဲလ်ကိုလည်း သေစေပါသည်။ ယေဘုယျအားဖြင့် ဆဲလ်တွင် ဖော်ပြထားသော ပျော်ဝင်နိုင်သော ပရိုတင်းများလေ ပိုကောင်းလေဟု ကျွန်ုပ်တို့ မျှော်လင့်ပါသည်၊ သို့သော် IPTG ၏ ပါဝင်မှု အလွန်မြင့်မားသောအခါတွင် ပါဝင်မှုများစွာ ဖြစ်ပေါ်လာပါလိမ့်မည်။ ခန္ဓာကိုယ်တွင် ပျော်ဝင်နိုင်သော ပရိုတင်းပမာဏ လျော့နည်းသွားပါသည်။ ထို့ကြောင့် အသင့်တော်ဆုံး IPTG ပါဝင်မှုသည် ကြီးလေ ပိုကောင်းလေ မဟုတ်ဘဲ ပါဝင်မှု နည်းပါးလေဖြစ်သည်။
မျိုးရိုးဗီဇပြုပြင်ထားသော မျိုးကွဲများကို ထုတ်ဖော်ခြင်းနှင့် ပြုစုပျိုးထောင်ခြင်း၏ ရည်ရွယ်ချက်မှာ ပစ်မှတ်ပရိုတင်း၏ ထွက်နှုန်းကို တိုးမြှင့်ရန်နှင့် ကုန်ကျစရိတ်များကို လျှော့ချရန်ဖြစ်သည်။ ပစ်မှတ်မျိုးရိုးဗီဇ၏ ဖော်ပြမှုသည် မျိုးကွဲ၏ကိုယ်ပိုင်အချက်များနှင့် ဖော်ပြမှု ပလာစမစ်တို့ကြောင့်သာမက၊ inducer ၏ ပါဝင်မှု၊ induction အပူချိန်နှင့် induction အချိန်ကဲ့သို့သော အခြားပြင်ပအခြေအနေများကြောင့်လည်း သက်ရောက်မှုရှိသည်။ ထို့ကြောင့် ယေဘုယျအားဖြင့် မသိသောပရိုတင်းတစ်ခုကို ဖော်ပြပြီး သန့်စင်ခြင်းမပြုမီ သင့်လျော်သောအခြေအနေများကို ရွေးချယ်ပြီး အကောင်းဆုံးစမ်းသပ်မှုရလဒ်များ ရရှိရန် induction အချိန်၊ အပူချိန်နှင့် IPTG ပါဝင်မှုကို လေ့လာခြင်းသည် အကောင်းဆုံးဖြစ်သည်။
ပို့စ်တင်ချိန်: ၂၀၂၁ ခုနှစ်၊ ဒီဇင်ဘာလ ၃၁ ရက်